Alberto Baldi y Alejandro G. Mladovan,
Laboratorio de Patología Molecular
Instituto de Biología y Medicina Experimental-CONICET
Vuelta de Obligado 2490 (1428) Buenos Aires. Argentina
E-Mail: abaldi@dna.uba.ar
Los vasos sanguíneos se originan mediante dos procesos, denominados vasculogénesis y angiogénesis. El primero se inicia en el periodo embrionario a partir de células progenitoras multipotentes. Mientras que en la angiogénesis, se crean nuevas redes vasculares a partir de las preexistentes.
Estos mecanismos están controlados por factores originados en células vecinas que contribuyen a la proliferación y desarrollo de las células endoteliales que forman el lecho de los vasos sanguíneos. Este proceso es mediado en condiciones normales y patológicas por estímulos pro y anti-angiogénicos.
Específicamente ligado a la proliferación tumoral la abundante vascularización observada en los tumores permite la llegada de elementos nutritivos y la diseminación de células neoplásicas dando lugar a la metástasis. Numerosos resultados indican que las nuevas terapias basadas en la inhibición de la angiogénesis tumoral juegan un papel importante en el control de la enfermedad.
Angiogénesis. Descripción general
En adultos, la angiogénesis es un evento infrecuente excepto durante la cicatrización de heridas o en procesos asociados con el ciclo menstrual y la implantación del óvulo. En cambio, en ciertas patologías como en la aparición de tumores, la retinopatía diabética y la artritis reumatoidea, se generan estímulos pro-angiogénicos (1).
El componente principal de los vasos sanguíneos es la célula endotelial que forma el canal del lecho vascular, organizándose para formar tubos que posibilitan la circulación sanguínea.
El proceso angiogénico comprende diversas etapas relacionadas secuencialmente. Se inicia con la vasodilatación y desestabilización del vaso preexistente, la degradación enzimática local de la membrana basal de los vasos y continúa con la proliferación y migración de las células endoteliales, reclutando a células circundantes en dirección al estímulo mitogénico. El proceso finaliza con la organización de las estructuras tridimensionales con la participación de las células de soporte dando lugar a vasos sanguíneos funcionales.
Estos mecanismos son controlados por diversos factores proteicos que se unen a receptores de la membrana de las células endoteliales, y en menor grado al de las células tumorales originando una cascada de fosforilaciones que activan la expresión de genes específicos involucrados en la proliferación del endotelio.
El factor angiogénico de mayor relevancia es el VEGF (del inglés Vascular endothelial growth factor) promoviendo la proliferación y diferenciación de las células endoteliales.
Otros factores participan también en la angiogénesis. Ellos incluyen a la familia de moléculas activadoras incluyen al FGF (Fibrobast growth factor), las angiopoyetinas, las integrinas avb3 y avb5, diversas metaloproteinasas, etc (2)
Contrariamente, factores como angiostatina, endostatina, trombospondina, interferón a y b, inhibidores de metaloproteinasas, y otros, son eficaces inhibidores de la angiogénesis y del crecimiento tumoral (3) (Tabla 1).
| Factores activadores de la angiogénesis |
Reguladores negativos de la angiogénesis |
- Familia del VEGF (diversas isoformas)
- FGF-1, FGF-2 (ácido y básico)
- PDGF (AA, AB, BB)
- Angiopoyetinas
- Ephrinas
- Timidina fosforilasa
- Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF)
- Interleuquinas 1, 6 y 8· Angiogenina
- Factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1)
- Miembros de la familia de Factores de crecimiento transformante tipob (TGFb)
- Factor de necrosis tumoral-a (bajas dosis)
- MMP 2, 9, 14, 15, 16, 17, 19 y 26
- Integrinas avb3, avb5 y a5b1
- VE-caderinas, PECAM (CD31)
- NOS, COX-2
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- Interferones a y b
- Interleuquinas 12 y 18· Factor de plaquetas 4 (PF-4)
- factor inducible por interferón (IP-10)
- Trombospondina
- Inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP 1, 2, 3, 4)
- Inhibidores de los activadores de plasminógenos
- Angiostatina (fragm. int. de plasminógeno)
- Endostatina (fragm. C-term. de colágeno XVIII)
- Canstatin (fragm. de colágeno IV)
- Antitrombina antiangiogénica
- Metalospondinas
- Factor derivado del epitelio pigmentado
- VEGFR-1, VEGFR-1 soluble, NP1soluble
- Prolactina
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FACTORES PRO-ANGIOGÉNICOS
VEGF y sus receptores
El VEGF, originalmente llamado factor de permeabilidad vascular, es el prototipo en la regulación de la vasculogénesis y la angiogénesis (4-5). Se considera al VEGF, como el miembro fundador de una familia de factores de crecimiento endotelial integrada por VEGF-A, B, C, D, y el factor de crecimiento placentario ó PIGF. Se ha establecido que VEGF-C y D están involucrados en la regulación in vivo de la linfoangiogénesis. El VEGF es una glicoproteína compuesta por dos unidades idénticas orientadas en sentido opuesto unidas por uniones -S-S-. Se han descrito seis isoformas del VEGF constituidas por 121, 145, 165, 183, 189 y 206 aminoácidos. Las mismas son codificadas por un único gen y se generan por "splicing alternativo". El gen humano responsable de la síntesis de VEGF está organizado en ocho exones, localizados en el cromosoma 6. EL VEGF165 carece de los residuos codificados por el exón seis, mientras que los exones seis y siete, no participan en la codificación de VEGF121.
VEGF121 y VEGF165 son las isoformas más abundantes y se expresan en un gran número de tumores siendo el VEGF165 más potente que VEGF121. El VEGF165 puede unirse al heparan-sulfato de los proteoglicanos en la superficie celular, quedando retenido hasta su eventual liberación por heparanasas.
La expresión de VEGF es imprescindible para la vida dado que la anulación de los dos alelos de VEGF en ratones "knockout", da por resultado una casi completa ausencia de vasculatura. Incluso ratones con un solo alelo funcional para VEGF, mueren en estado embrionario. Más aún, el VEGF continúa siendo crítico durante el desarrollo posterior al nacimiento, decreciendo su papel en el adulto.
También la regulación de su expresión es importante en el desarrollo del sistema vascular normal y en la angiogénesis patológíca. La permeabilidad vascular se incrementa en respuesta al VEGF, permitiendo la extravasación de proteínas plasmáticas, que favorecen la migración, proliferación y supervivencia de las células endoteliales.
Recientemente, se ha establecido que la tensión de oxígeno constituye un regulador fundamental de la expresión de VEGF y de otros factores (ver mas adelante). Otros factores que influyen en la síntesis de VEGF son: el factor de transformación-b o TGF-b, el factor estimulante de queratinocitos o KGF, el factor de crecimiento epidérmico o EGF, interleuquinas 1-a y 6, prostaglandina-2, angiotensina-II y corticotrofina, entre otros.
Receptores para VEGF
El VEGF interacciona a nivel de membrana de las células blanco con dos receptores que exhiben actividad de tirosina quinasa, designados VEGFR-1 y VEGFR-2, este último también conocido como KDR (2). La expresión de estos receptores ocurre predominantemente en células del endotelio y en sus precursores embrionarios.
Se demostró que ratones "knockout" para VEGFR-2, mueren en el útero entre 8.5 y 9.5 días post-fertilización como resultado de defectos tempranos en el desarrollo hematopoyético y de las células endoteliales (4). Por otra parte, ratones "knockout" para VEGFR-1, mueren en un tiempo similar. Sin embargo, muestran progenitores hematopoyéticos normales y células endoteliales abundantes que migran y proliferan, aunque incapaces de formar vasos funcionales.
De esta manera, VEGFR-2 parece jugar una función preponderante como el transductor más importante de la señal de VEGF dando lugar a la migración y proliferación de las células endoteliales. La interacción entre VEGF y KDR induce la actividad de tirosina quinasa del receptor y su autofosforilación, seguido de una cascada de señales citoplasmáticas que activan diversas vías de transducción como los sistemas de PKC, MEK-MAPK y PI3K-Akt. Ello promueve la proliferación y supervivencia endotelial y activa al sistema óxido nítrico sintasa que favorece la vasodilatación y permeabilidad celular (3).
En cambio, el VEGFR-1, parece actuar como un "receptor señuelo", regulando la accesibilidad del VEGF hacia un determinado tejido (5). Se demostró además, la existencia del VEGFR-3 expresado mayormente en tejido linfático, ligante de VEGF-C y VEGF-D.
Otras proteínas son capaces de unir específicamente VEGF165, como neuropilin-1 o NP-1. Se ha establecido que neuropilin-1 se encuentra asociada al endotelio, y también se expresa en la superficie de células tumorales derivadas de carcinoma de mama, próstata y melanoma (6). Neuropilin-1 une específicamente la isoforma VEGF165, pero no a VEGF121, actuando como co-receptor potenciando la unión de VEGF165 a KDR, sin embargo, carece de actividad de tirosina quinasa.
FGF-2
El FGF forma parte de una familia de más de 20 proteínas diferentes que se distribuyen en varios tejidos. El FGF-2, también denominado FGFb (básico) interviene en gran número de efectos biológicos, como por ejemplo en el desarrollo embrionario, la tumorigénesis y la angiogénesis (7). La acción biológica del FGF es mediada por cuatro receptores tirosina quinasa denominados FGFR-1, 2, 3 y 4, los cuales pueden generar diversas variantes por "splicing alternativo" exhibiendo un amplio espectro de expresión tisular que posibilita un extenso rango de interacciones receptor-ligando. Dicha unión induce la dimerización del receptor y su auto-fosforilación en tirosina, activando la transcripcion y traducción de nuevas moléculas.
El FGF-2 se encuentra normalmente unido al heparan-sulfato o a proteoglicanos de la matriz extracelular. Su liberación se regula a través de heparanasas o de proteasas de proteoglicanos. Asimismo, el heparan-sulfato actúa como co-receptor del FGF-2, promoviendo su dimerización y favoreciendo su unión al receptor, con la consecuente activación del mismo. El FGF-2 también puede ser movilizado de la matriz extracelular por el VEGF165 o por la acción de una proteína "chaperona", conocida como "proteína de unión a FGF" (FGF-BP), que favorece la interacción con el receptor.
Tanto FGF-2 como FGF-1 (ácido) son potentes inductores del proceso angiogénico y suelen encontrarse incrementados en diversos modelos de cáncer humano y experimental.
Angiopoyetinas y Tie-2
Las angiopoyetinas forman parte de un sistema muy particular asociado funcionalmente al VEGF. Se describieron como ligandos de Tie (Tyrosine kinase and Ig and EGF homology domains), que se expresa preferentemente en el endotelio vascular, en forma similar a los receptores para VEGF.
Se han descrito cuatro miembros de la familia de angiopoyetinas, siendo Ang1 y 2 las mejor estudiadas. Todas se unen al receptor Tie2, pero no es claro si existe algún ligando específico para Tie1.
Ang1 es un factor paracrino producido por células de soporte vascular (pericitos), que optimiza la interacción e integración entre estas células y el endotelio y permite la formación de vasos poco permeables. Asimismo, el complejo Ang1/Tie2 es constitutivo en el endotelio adulto y necesario para su quiescencia o estado de reposo.
Ratones "knockout" para los genes Ang1 o Tie2, desarrollan una vasculatura aparentemente normal, pero presenta fallas en su remodelación posterior. La sobreexpresión de VEGF y Ang1 conduce a una vascularización muy marcada por el incremento en el número y tamaño de los vasos. A partir de estos estudios, se determinó que VEGF y Ang1 evocan efectos distintos sobre la funcionalidad e integridad vascular. Así VEGF genera vasos inmaduros, permeables y hemorrágicos, mientras que Ang1 contribuye al "sellado" y remodelado de los mismos.
La Ang2, puede activar o inhibir Tie2 y su expresión se restringe a zonas de remodelación vascular (8).
Una incógnita aún no aclarada se relaciona con Tie-1 (un receptor sin ligando conocido). Se especula que estaría involucrado en la heterodimerización con Tie-2 inducida por Ang2, bloqueando así su actividad.
Receptores Eph y sus Ligandos
Este grupo de moléculas fue caracterizado inicialmente en el sistema nervioso embrionario y está constituido por un grupo de receptores denominados Eph y sus ligandos llamados ephrinas, ambos se encuentran anclados a la membrana extracelular. Estas especies moleculares se dividen en dos subclases, A y B, los ligandos ephrin-B se unen preferentemente a receptores de la subclase Eph-B (9).
Estudios recientes con ratones "knockout", sugieren un papel crítico de ephrin-B2 y su receptor Eph-B4, durante el desarrollo vascular. Ratones deficientes en dichos genes sufren efectos fatales durante su vida embrionaria que de alguna manera semejan a los observados en ratones carentes de Ang1 o Tie2. La expresión de ephrin-B2 se restringe al endotelio arterial, mientras que Eph-B4 está presente en el endotelio venoso (10).
Integrinas como marcadores angiogénicos
Las integrinas son proteínas de transmembrana compuestas por diferentes subunidades a y b, capaces de formar más de 20 heterodímeros diferentes. Unen proteínas de la matriz extracelular o ligandos de la superficie celular a través de secuencias peptídicas cortas. La expresión de integrina avb3 es mínima en el endotelio en reposo y aumenta notablemente durante la angiogénesis. La inhibición de la interacción de avb3 con su ligando induce la apoptosis endotelial. De esta forma, avb3 actúa como un biosensor para facilitar la muerte celular cuando el endotelio interacciona con una matriz extracelular "inapropiada", facilitando una morfogénesis vascular correcta y evitando la formación de vasos en sitios incorrectos.
Regulación de la angiogénesis por hipoxia
Las células de mamíferos superiores son capaces de sensar el oxigeno regulando un número de genes en respuesta a la hipoxia (11). Esto es posible a través del factor transcripcional HIF-1 que activa la expresión de diversos genes involucrados en el proceso angiogénico. Dicho factor está compuesto por dos subunidades (a y b) de las cuales, solo HIF-1a es capaz de responder a los niveles de O2. Es interesante destacar que en normoxia, HIF-1a es hidroxilado en el aminoácido prolina del dominio ODD, a través de la enzima HIF-prolil hidroxilasa. Esta modificación de HIF-1a posibilita su unión al producto del gen supresor tumoral VHL involucrado en la enfermedad de von Hippel-Lindau, (7). Esta unión "marca" a HIF-1a para su degradación por el sistema proteasomal. Asimismo, el dominio C-TAD, es el encargado de reclutar a complejos co-activadores.
Dicha asociación se encuentra bloqueada en normoxia debido a la hidroxilación del aminoácido asparragina, presente en C-TAD. De tal manera, en presencia de niveles normales de O2, la hidroxilación de estos aminoácidos promueve la degradación de HIF-1a e impide su interacción con proteínas co-activadoras. En cambio, durante la hipoxia, la hidroxilación dual de HIF-1a no tiene lugar. Así, se impide la unión de VHL, aumentando la vida media de la proteína permitiendo la formación del heterodímero HIF-1a/HIF-1b, posibilitando la asociación con los activadores de la transcripción p300/CBP. Este complejo puede interaccionar con los elementos respondedores del ADN para la respuesta a la hipoxia o HRE, incrementando la expresión de diversos genes como VEGF, VEGFR-1, Tie2, favoreciendo el proceso angiogénico.
FACTORES ANTI ANGIOGÉNICOS
Muchos tumores malignos generan inhibidores de neovascularización. Los más importantes son: agiostatina y endostatina.
Angiostatina
Es una proteína de 38 kDal que inhibe específicamente la proliferación del endotelio vascular (12). Estructuralmente, es un fragmento derivado del plasminógeno por acción de proteasas como serina elastasa y diversas metaloproteinasas. En su configuración presenta 3 o 4 zonas denominadas "kringles" (forma de una delicia danesa). Se ha demostrado que la aplicación sistémica de angiostatina recombinante, produce un aletargamiento de las metástasis experimentales producto del balance entre apoptosis y proliferación de las células tumorales. No se ha determinado aún el mecanismo de acción de este inhibidor.
Endostatina
La endostatina es un inhibidor de la angiogénesis aislado a partir de un hemangioendotelioma murino (13). Es un fragmento de 20 kDal del extremo carboxi-terminal del colágeno XVIII, una proteína asociada con diversas membranas basales. La escisión del colágeno XVIII es catalizada catepsina L y elastasa (14). La endostatina resultante contiene un elevado número de arginina que resulta crítica para la unión a heparina y al heparan-sulfato de diversos proteoglicanos de la superficie celular, que actúan como receptores para la endostatina. Si bien no se ha elucidado el mecanismo de acción de este inhibidor, recientes trabajos indican que la endostatina podría interactuar con KDR o competir por los proteoglicanos necesarios para la co-activación del FGF. Asimismo, se ha observado en células tratadas con endostatina, un incremento de la apoptosis, además de la disminución en la expresión de genes que participan en la progresión del ciclo celular.
Se demostró que endostatina recombinante, inhibe el desarrollo de tumores de Lewis, fibrosarcomas, hemangioendotelioma y melanoma, en animales de experimentación.
Bibliografia
1. - Folkman J. y Shing Y., J. Biol. Chem. 267:10931,1992
2. - Hanahan D., Science 277:48,1997
3. - Griffioen A.W. y Molema G., Pharmacol. Rev. 52:237,2000
4. - Luttun A. et al Nature Medicine 8:831,2002
5. - Risau W., Nature 386:671,1997
6. - Soker S. et al., Cell 92:735,1998
7. - Cross M.J. y Claesson-Welsh L., Trends in Pharmacol. Sci. 22:201,2001
8. - Jones N. et al., Nature Reviews 2:257,2001
9. - Gale N.W. et al., Genes Dev. 13:1055,1999
10.- Wang H.U. et al., Cell 93:741,1998
11.- Giordano F.J. y Johnson R.S., Current Opinion in Gen. & Dev. 11:35,2001
12.- O´Reilly M.S., et al. Cell 79:315, 1994
13.- O´Reilly M.S., et al. Cell 88:277,1997
14.- Wen W. et al., Cancer Res. 59:6052,1999