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Un muy interesante trabajo sobre una bacteria que por mal manejo de antibióticos en los primeros tiempos se convirtió en un serio problema de salud.

Staphylococcus aureus:
SENSIBILIDAD ANTIBIÓTICA Y DETECCIÓN DE ENTEROTOXINAS DE CEPAS AISLADAS DE ALIMENTOS Y MANOS DE MANIPULADORES

L. Gubbay1, L. Galanternik1, G.Galan2, J. Cabrera Durango3, M. Galas2, C. Degrossi4 1 Laboratorio Lamyc, 2 A.N.L.I.S. "Dr. Carlos G. Malbrán". 3 INAL-ANMAT. 4 Universidad de Belgrano.


RESUMEN

Entre mayo de 2002 y enero de 2003 se investigó la presencia de Staphylococcus aureus coagulasa (+) en 236 alimentos listos para consumir y en 184 hisopados de manos de manipuladores. Se aislaron 40 cepas (ICMSF, 2000), 24 de alimentos y 16 de hisopados de manos. Todas resultaron termonucleasa (+). En 17 de estas cepas, aisladas de 15 muestras elegidas al azar (7 alimentos y 8 hisopados de manos) se estudió la capacidad de producción de enterotoxinas (ET) (VidasâSystem) y la sensibilidad frente a 14 antibióticos (NCCLS, 2000). El 59 % (10 cepas) resultó ET (+). Respecto a las pruebas de sensibilidad a antibióticos, 16 de las 17 cepas investigadas fueron resistentes a penicilina (94%), siendo la cepa sensible, ß-lactamasa negativa. La resistencia que se observó frente a este antibiótico fue semejante a la informada por el programa de vigilancia de la resistencia antimicrobianos WHONET - Argentina en muestras clínicas (2002). Se comprobó una baja resistencia frente al resto de los antibióticos ensayados, con sólo 1 cepa resistente a la gentamicina.

La alta proporción de cepas enterotoxigénicas resalta la importancia de la capacitación de los manipuladores de alimentos en higiene personal, principalmente en el correcto lavado de las manos, como así también en Buenas Prácticas de Elaboración, como estrategia fundamental para prevenir brotes de enfermedades transmitidas por alimentos por este microorganismo.


INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus es un microorganismo ubicuo, cuyo habitat principal es la piel, sus glándulas anexas y las mucosas de los animales de sangre caliente. En los portadores humanos, se multiplica primariamente en la nariz, sitio que puede ser colonizado durante los primeros días de vida. Muchos portadores nasales también lo portan en la piel, ya que el hábito de tocarse la nariz hace que S. aureus pase a las manos. Si bien es considerado un comensal, parte de la microflora normal permanente o transitoria, en ocasiones se convierte en un patógeno oportunista, causando desde infecciones menores en piel, hasta cuadros sistémicos, que pueden llevar a la muerte. S. aureus es, por lo tanto, un microorganismo de gran importancia en clínica, en especial por las cepas meticilino resistentes (SAMR), conocidas desde hace más de 30 años (Adams y Moss, 1997; Jones y col.,2002; Sandel y McKillip, 2004).

Además de su importancia en clínica, Staphylococcus aureus es considerado mundialmente uno de los agentes más importantes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Sin embargo, al tratarse en la mayoría de los casos de cuadros gastrointestinales leves, autolimitantes, los brotes por este microorganismo, generalmente no son notificados (Jablonsky y Bohach, 1997). En el año 2002, de acuerdo a los datos del Sistema de Vigilancia Epidemiológica (SINAVE) de la Dirección de Epidemiología, dependiente del Ministerio de Salud de la Nación, se notificaron en Argentina 58 brotes de ETA, 4 de los cuales correspondieron a S. aureus, con un total de 65 afectados.

S. aureus causa un cuadro de intoxicación que resulta de la ingestión de una o más enterotoxinas (ET) preformadas en el alimento. Son proteínas de bajo peso molecular que resisten la acción de enzimas digestivas y son relativamente estables al calor. Por métodos serológicos pueden diferenciarse 14, de las cuales 7 están bien caracterizadas bioquímicamente: A, B, C1, C2, C3, D y E. Se han hecho muchos esfuerzos por intentar relacionar la producción de ET con diferentes propiedades bioquímicas de los estafilococos, principalmente las pruebas de coagulasa y termonucleasa. Sin embargo, no todas las cepas coagulasa y/o termonucleasa positivas, son enterotoxigénicas y recientemente se demostró que cepas de S. aureus productoras de ET, eran coagulasa y/o termonucleasa negativas (Omoe y col., 2002; Soriano y col. 2002).

La presencia de estafilococos en los alimentos generalmente se debe a la contaminación directa por manipuladores colonizados. Dado que es mal competidor, el problema se presenta durante la manipulación de alimentos ya procesados o cocidos, en los que la flora competitiva está inhibida o fue eliminada (Sandel y McKillip, 2004). De acuerdo a la Administración de Alimentos y Drogas de Estados Unidos (US Food and Drug Administration, 1992), cuando la población de S. aureus es superior a 105 organismos por gramo de alimento contaminado, se alcanza la dosis efectiva de ET para causar la intoxicación. Por lo tanto, entre los factores que conducen a brotes por S. aureus, el mantenimiento del alimento, por un tiempo prolongado, en la zona de temperaturas peligrosas (entre 4 y 60° C), es esencial. De esta manera el microorganismo se multiplica y produce la toxina, que no se destruye por un tratamiento térmico posterior (Sandel y McKillip, 2004).

Las intoxicaciones por S. aureus no requieren del uso de antibióticos, motivo por el cual generalmente no se realizan pruebas de sensibilidad a antimicrobianos de las cepas aisladas de alimentos o manos de manipuladores. Sin embargo, en 1995 se produjo un brote por SAMR en un hospital, en el que 21 pacientes de hematología se vieron afectados y 5 murieron. La investigación señaló a los alimentos como vehículo de esta cepa, confirmándose la presencia de un manipulador colonizado por la misma (Kluytmans y col., 1995). Recientemente, Jones y col. (2002) describieron en Estados Unidos, el primer brote una intoxicación alimentaria en la comunidad cuyo agente etiológico fue una cepa SAMR, productora de enterotoxina C.

En el presente trabajo se realizó un estudio prospectivo con el fin de investigar la producción de enterotoxinas, su relación con pruebas bioquímicas y la sensibilidad antibiótica de cepas de S. aureus coagulasa positivas, aisladas de alimentos listos para consumir y de las manos de manipuladores.


MATERIALES Y MÉTODOS

Entre mayo de 2002 y enero de 2003, se tomaron 236 muestras de alimentos listos para consumir y 184 hisopados de manos de manipuladores, durante auditorias realizadas en comedores de fábricas y locales de expendio de comidas de la ciudad de Buenos Aires y sus alrededores, en las que se investigó la presencia de Staphylococcus aureus. Los alimentos se colocaron en recipientes estériles. Las muestras de las manos se tomaron mediante hisopos de algodón estériles que se frotaron sobre palma, dorso y espacios interdigitales de manipuladores preparando alimentos listos para consumir y luego se colocaron en tubos con 1 ml de en agua peptonada al 0,1 %. En todos los casos, las muestras se transportaron al laboratorio refrigeradas y el análisis se realizó dentro de las 3 h.

Investigación de Staphylococcus aureus
Muestras de alimentos: en cada muestra se pesaron asépticamente 10 g de alimento en un recipiente con 90 ml de agua peptonada al 0,1 % y se sembraron por duplicado 0,1 ml de esta dilución en la superficie de Baird Parker, incubándose a 35°C durante 48 h (ICMSF, 2000). Se estudió la presencia de S. aureus en aquellas muestras que presentaron recuentos presuntivos mayores o iguales a 102 u.f.c./g. Las cepas se reaislaron en agar Baird Parker y en agar Manitol salado. Las colonias sospechosas se sembraron en tubo de agar nutritivo inclinado para su posterior confirmación por pruebas de identificación: coloración de Gram, catalasa y coagulasa. Las cepas que resultaron cocos Gram +, catalasa y coagulasa +, se confirmaron por el sistema multipruebas API STAPH (bioMérieux).
Hisopados de manos: se estriaron los hisopos en placas de agar Baird Parker y a partir de las colonias sospechosas se procedió de la forma indicada en las muestras alimentos.
Prueba de la termonucleasa: se realizó en todas las cepas, en placas de medio con ADN y se reveló con ClH 0,1 N.

Investigación de la producción de enterotoxinas y la sensibilidad a antibióticos En un total de 17 cepas, aisladas de 15 muestras seleccionadas al azar, 7 alimentos y 8 de hisopados de manos, se investigó la producción de enterotoxinas (ET) y se realizaron pruebas de sensibilidad a antibióticos. Cabe señalar que a partir de un hisopado y un alimento se aislaron 2 cepas con características morfológicas diferentes.

Detección de ET: Se realizó por medio de la técnica inmunoenzimática fluorescente E.L.F.A. (Enzyme Linked Fluorescent Assay) utilizando reactivos VIDAS Staph enterotoxin (SET) que permiten la detección de las siete enterotoxinas de Staphylococcus (A, B, C1, C2, C3, D y E) mediante el sistema automatizado miniVIDAS (bioMérieux). Se inocularon las 17 cepas de S. aureus en caldo infusión cerebro corazón y se incubaron 18 h a 37° C. Luego de centrifugar los caldos a 15.3000 r.p.m. durante 15 minutos se ensayaron en cada caso, 500 µl de los sobrenadantes con los reactivos VIDAS SET.

Pruebas de sensibilidad a antibióticos: Se realizaron, en 17 cepas, por el método de difusión con discos según las normas de la National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS, 2000). Se probaron los siguientes antibióticos: penicilina (pen), eritromicina (ery), clindamicina (cli), rifampicina (rif), lincomicina (lin), nitrofuranos (nit), gentamicina (ge), cotrimoxazol (cox), vancomicina (van), teicoplanina (tei), cloranfenicol (cmp), fosfomicina (fos), tetraciclina (tet), ciprofloxacina (cip), oxacilina (oxa).


RESULTADOS

Como se indica en el Gráfico 1, de las 236 muestras de alimentos listos para consumir se aislaron 24 cepas de S. aureus coagulasa positivas y 16, de los 184 hisopados de manos de manipuladores. Todas resultaron termonuclesa positivas.
De las 17 cepas investigadas, 10 resultaron enterotoxigénicas (59 %), de las cuales 5 se aislaron de hisopados de manos y 5 de alimentos (Gráfico 2).
En la Tabla 1 se resume la información sobre las preparaciones de las que se aislaron las distintas cepas de S. aureus y su capacidad de producir ET.
Respecto a las pruebas de sensibilidad a antibióticos, 16 de las 17 cepas investigadas fueron resistentes a penicilina (94%), siendo la cepa sensible, ß-lactamasa negativa. Sólo 1 cepa fue resistente a la gentamicina, resultando no productora de enterotoxina.


DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

El porcentaje de portadores de S. aureus en manos de manipuladores de alimentos detectado en este trabajo (9%), es coincidente con el señalado por Hatakka y col. (2000) en empleados de cocina de una empresa de catering aéreo. Los autores tomaron hisopados nasales (153) y de manos (136) entre 1995 y 1997, observando una mayor prevalencia de S. aureus en las muestras nasales (29%) que en manos (9%). Los estudios realizados en manos, en la comunidad, señalan valores entre el 8 y 28 % de portadores de S. aureus (Amstrong y Smith, 1976; Namura y col., 1995).
Todas las cepas aisladas en este trabajo resultaron simultáneamente coagulasa y termonucleasa positivas y el 59% fueron enterotoxigénicas. En particular, de las 8 cepas aisladas de alimentos listos para consumir (Tabla 1), 5 resultaron enterotoxigénicas (63%). Scarpini y col (2000), aislaron 60 cepas de S. aureus coagulasa positivas de quesos de elaboración industrial y artesanal en la ciudad de Gualeguaychú, Entre Ríos, de las cuales sólo 7 dieron positiva la prueba de la termonucleasa. Seleccionaron 11 de estas cepas en las que investigaron la capacidad de producción de ET, encontrando 5 (45%) enterotoxigénicas.
Como fue señalado, de un mismo alimento (Tabal 1, budín de calabaza) se aislaron 2 cepas de S. aureus con características morfológicas diferentes en agar Manitol salado y sólo una de ellas resultó productora de ET. Estas cepas presentaron los mismos resultados en las pruebas de sensibilidad a antibióticos. A partir de uno de los hisopados de manos, también se aislaron 2 cepas morfológicamente diferentes, y sólo una de ellas productora de ET. En este sentido, Acco y col. (2003) probaron que 11 de 14 hisopados nasales de manipuladores de alimentos revelaron la presencia de múltiples cepas de S. aureus.
Se realizaron las pruebas de sensibilidad a 17 cepas, 16 de las cuales fueron resistentes a penicilina (94%). Este resultado es semejante al informado por la red de vigilancia WHONET- Argentina (2002) en muestras clínicas.
La alta proporción de cepas enterotoxigénicas resalta la importancia de la capacitación de los manipuladores de alimentos en higiene personal, principalmente en el correcto lavado de las manos, como así también en Buenas Prácticas de Elaboración, como estrategia fundamental para prevenir brotes de enfermedades transmitidas por alimentos por este microorganismo.


REFERENCIAS

  • Acco, M., Ferreira, F.S., Henriques, J.A.P., and Tando, E.C. (2003). Identification of multiple strains of Staphylococcus aureus colonizing nasal mucosa of food handlers. Food Microbiol., 20, 489-493.
  • Adams, M.R. y Moss, M.O. (1997). Microbiología de los Alimentos (pág. 258-264). Ed. Acribia, Zaragoza, España.
  • Amstrong-Esther, C.A., and Smith, J.E. (1976). Carriage patterns of Staphylococcus aureus in healthy non-hospital population of adults and children. Ann. Hum. Biol., 3, 221-227.
  • Hatakka, M., Asplund, K., and Korkeelala, H.J. (2000). Genotypes and enterotoxicity of Staphylococcus aureus isolated from hands and nasal cavities of flight-catering employees. J. Food Prot., 63, 1487- 1491.
  • ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) (2000). Microorganismos de los alimentos, volumen 1. Ed. Acribia, Zaragoza, España.
  • Jablonski, L.M., and Bohach, G. (1997). Staphylococcus aureus. En M. P. Doyle, L. R. Beuchat , and T. J. Montville (Ed.), Food microbiology: fundamentals and frontiers (pp. 353-375). Washington DC: ASM Press.
  • Jones,T.F., Kellum, M.E., Porter, S.S., Bell, M., and Schaffner, W. (2002). An Outbreak of Community-Acquired Foodborne Illness Caused by Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. EID, vol. 8, 1. http://www.cdc.gov/ncidod/eid/vol8no1/01-0174.htm
  • Kluytmans, J., van Leeuwen, W., Goessens, W., Hollis, R., Messer, S., Herwaldt, L., Bruining, H., Heck, M., Rost, J., van Leeuwen, N., et al. (1995) Food-initiated outbreak of methicillin-resistant Staphylococcus aureus analyzed by pheno- and genotyping. J. Clin. Microbiol. , 33, 1121-1128
  • Namura, S., Nishijima, S., Higashida, T., and Asada, Y. (1995). Staphylococcus aureus isolated from nostril anteriors and subungual spaces of the hand: comparative study of medical stuff, patients and normal controls. J. Dermatol. 22, 175-180.
  • NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standars) (2000). Approved standard M100-s10. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, PA.
  • Omoe, K. Ishikawa, M., Shimoda, Y. Hu, D., Ueda, S., and Shinagawa, K. (2002). Detection of seg, seh, or sei genes in Staphylococcus aureus isolates and determination of the enterotoxin productivities of S. aureus isolates harboring seg, seh, or sei genes . J. Clin. Microbiol., 40, 857-862.
  • Sandel, M.K., and McKillip, J.L. (2004). Virulence and recovery of Staphylococcus aureus relevant to the food industry using improvements on traditional approaches. Food Control 15, 5-10.
  • SINAVE, Dirección de Epidemiología, Ministerio de Salud de la República Argentina; http://www.direpi.vigia.org.ar Soriano, J.M., Font, G., Moltó, J.C. y Mañes, J. (2002). Enterotoxigenic staphylococci and their toxins in restaurant foods. Trends in Food Sci. & Tech. 13, 60-67.
  • US Food and Drug Administration, 1992. Foodborne pathogenic microorganisms and natural toxins. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Rockville, Maryland, USA; http://vm.cfsan.fda.gov/~mow/chap3.html
  • WHONET - Argentina, Programa para la Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos, OMS; www.guti.gov.ar/laboratorio/labc_act.htm

    Tabla 1 Producción de ET de cepas de S. aureus aisladas de alimentos listos para consumir

    Fuente ET
    Budín de calabaza a + -
    Torta salada de panqueques, jamón y verduras b +
    Torta salada de panqueques, jamón y verduras b +
    Ensalada de remolacha y mayonesa +
    Queso cortado en aceite -
    Arroz primavera -
    Atún de lata, abierto, guardado en heladera +

    a: del budín de calabaza se aislaron dos cepas morfológicamente diferentes

    b: las muestras fueron tomadas en diferentes auditorias